Каков Западный Протокол Пятна?
Западный протокол пятна - точные стандарты, по которым проводится тест иммуноблота. Западное пятно используется, чтобы обнаружить белки в образце ткани. Процесс отделяет родные белки, определяя длины полипептидов, используя электрофорез в геле. Сами белки тогда переданы мембране нитроцеллюлозы и исследованы антителами.
первая часть западного протокола пятна начинается с совокупности ткани. Эти образцы собраны или из живой ткани или из клеточной культуры. Ткань сломана, и различные ингибиторы, такие как протеаза или фосфатаза представлены препятствовать тому, чтобы ферменты выполнили вываривание. Эта часть протокола обычно обрабатывается в холодных температурах, чтобы сохранить ткани.
процесс электрофореза в геле следующий шаг в западном протоколе пятна. В этой части белки идентифицированы различными факторами, такими как молекулярная масса или электрический налог. Этот процесс обычно закончен, используя полиакриломидные гели с буфером натрия dodecyl сульфат. В основном, белки становятся отрицательно заряженными и двигают положительно заряженный электрод в пределах геля.
Передача белков - следующая часть полного западного процесса пятна. Мембрана помещена сверху геля, сопровождаемого фильтровальной бумагой. Поскольку электрическим током управляют, белки потянулись в мембрану. Это упоминается как фактический blotting І часть анализа. Мембраны - очень хрупкое и легко склонное повреждение.
Правильный поток западного протокола пятна призывает к шагу, известному как закрепление. Чтобы предотвратить загрязнение белков непосредственно антителами, которые должны быть добавлены, своего рода экранирование должно быть осуществлено. Наиболее распространенный тип блокирования использования обезжиренное сухое молоко и моющее средство. Это затвердевает к открытым пятнам в мембране и учитывает более ясные результаты, когда антитело добавлено.
Обнаружение - следующий шаг согласно правильному протоколу. Белки представлены антителам, которые были связаны с определенным ферментом, который даст исследователям желаемую информацию. Антитело культивировано с мембраной в течение 30 минут или больше. Позже, мембрана вымыта, и вторичное антитело представлено, который затвердевает к первому. Часто, люминесцентный агент используется, чтобы помочь ученым с процессом идентификации.
Материал вымыт снова, чтобы удалить любые несвязанные пункты. Анализ размера запятнанных диапазонов показывает информацию относительно выдающегося положения и степени определенного белка. Это вообще закончено несколько раз, чтобы гарантировать надлежащего анализа. Возможности для обнаружения включают рентгеновское излучение, окраску и химикаты.